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用Asp-His-Cys三联体进行共价催化，在两个桶之间分开（β1上的Asp与β2上的His和Cys）。底物保持为β折叠，与桶之间的裂缝形成反平行相互作用，并与C端形成平行相互作用。因此，酶在底物周围形成结合隧道，侧链相互作用控制特异性。
优选的天然切割序列首先通过检查天然多蛋白底物中的切割位点的重复序列来鉴定。这些天然切割位点的共识是ENLYFQ\S，其中“\”表示切割的肽键。底物的残留物在切割位点之前标记为P6到P1，在切割位点之后标记为P1'。早期的工作还测量了一系列相似底物的切割，以表征蛋白酶对天然序列的特异性。
随后的研究使用从随机序列池中切割底物的测序来确定偏好模式。尽管ENLYFQ\S是最佳序列，但蛋白酶在一系列底物上或多或少都有活性（即显示出一些底物混杂）。最高切割是最接近共有EXLYΦQ\φ的序列，其中X是任何残基，Φ是任何大或中等疏水基，φ是任何小的疏水或极性残基。虽然这个序列是最优的，但如果序列的其余部分是最优的，那么在某些位置具有不利残基的序列仍然可以被切割。
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